Розробка моделі аритмогенної кардіоміопатії з використанням CRISPR-Cas9 та гомологічно-спрямованої репарації

Анотація

Аритмогенна кардіоміопатія (АКМ, ACM) часто зумовлена варіантами гена PKP2 із втратою функції, що призводить до десмосомної недостатності, електричної нестабільності та фіброзно-жирової перебудови. Технологія CRISPR-Cas9 відкриває можливості створення людських in vitro моделей хвороби та оцінювання коригувальних підходів.

Мета. Створити клітинну модель аритмогенної кардіоміопатії шляхом CRISPR–Cas9-опосередкованого внесення варіанта PKP2 c.2011delC в індуковані плюрипотентні стовбурові клітини з подальшою алель-специфічною корекцією за допомогою репарації ДНК за гомологією (HDR).

Матеріали та методи. Ми реалізували два взаємодоповнювальні експерименти в системах людських індукованих плюрипотентних стовбурових клітин (iPSC): (i) індукція хвороби шляхом внесення патогенного варіанта PKP2 c.2011delC (екзон 10; p.Lys672Argfs*12) у контрольні iPSC; та (ii) терапевтична корекція цього самого варіанта в iPSC, отриманих від пацієнта. Клональні редагування підтверджували методом Сенгера/TIDE (Tracking of Indels by Decomposition) і довгофрагментною ПЛР (~2 кб); каріотипи були нормальними за G-бендінгом; позамішеневих ефектів не виявлено понад межі чутливості методів (TIDE ≈2 %, амплікон-секвенування ≤1 %). Кардіоміоцити, диференційовані з iPSC, аналізували на експресію/локалізацію PKP2 (імунофлуоресценція, IF/вестерн-блот), цілісність десмосом, електрофізіологію методом патч-клемп (тривалість потенціалу дії на 90 % реполяризації, APD90; аритмічні події), кальцієвий гомеостаз (Fluo-4; одиниця аналізу – диференціація; 5 клітин × 3 диференціації/групу) та фіброзно-жирову перебудову (Oil Red O, Пікросіріус Ред). Розміри вибірок наводили як N(лінії), n(диференціації) та n(клітини). Із пулу відредагованих пацієнтських клітин отримано 12 клонів; 9 були повністю скориговані, 6 ізогенних скоригованих ліній просунуті до функціонального тестування.

Результати. Індуковані-мутантні та пацієнтські мутантні кардіоміоцити відтворили ключові ознаки АКМ: рівень білка PKP2 становив ~34,2 % від контролю; порушена з’єднувальна локалізація PKP2/DSP/Cx43 (десмосомний бал 0,83±0,27 проти 2,91±0,17); APD90 подовжена до 275±18 мс проти 224±15 мс; частота аритмій – 78 % (здорові – 5 %). Кальцієва візуалізація показала зниження амплітуди ΔF/F₀ до 0,704±0,034 проти 1,000±0,039 і групові відмінності за частотою (здорові 1,009±0,024 Гц, АКМ 0,964±0,120 Гц, CRISPR-корекція 1,401±0,069 Гц; ANOVA p=0,0167; скориговані парні порівняння: тенденція «здорові vs CRISPR»). CRISPR-корекція відновила PKP2 до 92,1 % від контролю, покращила організацію десмосом до 2,68±0,19, скоротила APD90 до 225±13 мс, зменшила аритмії до 12 %, відновила амплітуду Ca²⁺ до 1,161±0,023 та нормалізувала відкладення колагену (4,8±0,6 %) і ліпідів (8,2±1,2 %).

Висновки. Двонапрямне редагування геному – патогенний knock-in для моделювання та ізогенна корекція для відновлення (rescue) – формує надійну людську платформу для дослідження АКМ. Корекція PKP2 c.2011delC усуває десмосомні, електричні, кальцієво-обмінні та фіброзно-жирові порушення, підтримуючи трансляційний розвиток підходів геномного редагування для аритмогенної кардіоміопатії.